Técnicas de microscopía para la mejora en resolución, obtención de seccionado óptico y medida cuantitativa de fase

La microscopía óptica convencional alcanzó el límite en resolución que predice la difracción por medio del empleo de sofisticados objetivos de microscopio, que consiguen la captura de la información espacial en el espacio de la muestra con un ángulo de captura de prácticamente 70º en aire, esto es, aperturas numéricas (NA) de 0.9 (y mayores si existe un medio de inmersión). Existe la posibilidad de sobrepasar dicho límite o, mejor dicho, encontrar otro límite en resolución siempre que el microscopio que se emplee no pueda entenderse como un microscopio convencional. Por otro lado, los microscopios convencionales carecen de capacidad de seccionado óptico ya que, cuando se tiene una muestra tridimensional, no sólo se obtiene la imagen de la zona enfocada dentro de la misma sino que se recibe luz de todos los planos que se encuentren fuera del plano de foco. Este efecto perturba la calidad de las imágenes bidimensionales obtenidas con el microscopio reduciendo notablemente el contraste y, además, impide la realización de imágenes tridimensionales a partir de la compilación de pilas de secciones ópticas obtenidas para distintos planos de foco. Nuevamente, es posible obtener la mencionada capacidad de seccionado óptico por medio del empleo de algunos microscopios ópticos no convencionales Además en los últimos años se han desarrollado una serie de técnicas alter-nativas a la microscopia convencional que son capaces de proporcionar in-formación de fase de las muestras, esto es, información de las variaciones de índice de refracción en su interior o del espesor de las mismas. Como veremos, dicha información de fase puede ser relevante en el estudio y la caracterización de distintos tipos de muestras. A pesar de que para alcanzar las prestaciones arriba mencionadas se debe aumentar la complejidad tecnológica con respecto a los microscopios convencionales, los beneficios que ello reporta justifica con creces dicha complejidad. Los objetivos de esta Memoria son múltiples. En primer lugar, se pretende aunar en un mismo marco teórico distintas técnicas pertenecientes a la microscopía óptica no convencional, en concreto, CLSM, SIM y DHM. Asimismo se mostrarán algunas de las limitaciones prácticas de las mismas. Para cada una de estas técnicas se presentarán propuestas de implementaciones alternativas así como las ventajas que representa el empleo de estos nuevos sistemas. Para llevar a cabo los objetivos arriba señalados, se comenzará tratando desde un punto de vista teórico la microscopía convencional en el Capítulo 2. Con ello, no sólo se presentará el tipo de cálculos que se requieren para la comprensión de las distintas técnicas de microscopía aquí recogidas, sino que también se podrán entender las limitaciones de la microscopía convencional de una manera estricta. En el Capítulo 3 se hará, en primer lugar, una introducción teórica acerca de la microscopía confocal de barrido. En éste realiza-remos una propuesta de un sistema de adquisición de imágenes confocales alternativo que, además, permitirá mejorar la calidad de las imágenes obtenidas. En el Capítulo 4 introduciremos la técnica SIM de manera rigurosa, pre-sentando los cálculos necesarios para la obtención de imágenes mediante este tipo de sistema. En este capítulo, distinguiremos entre los distintos sistemas que se pueden implementar y propondremos un novedoso sistema para gene-rar iluminación estructurada en el que la frecuencia del patrón de iluminación se pueda variar de una manera muy sencilla. Además, propondremos un algo-ritmo de reconstrucción alternativo para la obtención de imágenes. En el Capítulo 5 nos centraremos en la microscopía holográfica digital. Para llegar a entender el funcionamiento de este tipo de técnica, haremos una pequeña introducción teórica sobre holografía clásica y holografía digital. Esto nos permitirá entender las limitaciones de la técnica, a partir de lo cual realizaremos tanto una propuesta para mejorar sus prestaciones como un desarrollo teórico con el fin de optimizar los parámetros de captura. Por último, en el Capítulo 6, aunaremos las técnicas SIM y DHM en lo que llamaremos microscopía holográfica digital por iluminación estructurada (SI-DHM) en una propuesta novedosa para mejorar la resolución de un DHM convencional. Asimismo, pre-sentaremos un algoritmo mediante el cual se facilita la implementación práctica de esta técnica

Microscopía óptica

La microscopía es un conjunto de técnicas que se ha desarrollado por más de 300 años, que incluyen distintas metodologías altamente especializadas. Se clasifican en 3 grandes grupos: La Microscopía Óptica, la Microscopía Electrónica y la Microscopía por Sondas. Este capítulo está centrado en presentar una serie de técnicas incluidas dentro de la Microscopía Óptica que permiten estudiar procesos bioquímicos y biofísicos hasta a nivel (sub-)micrométrico, es decir a nivel de tejidos, celular, subcelular, o incluso molecular. Una de las grandes ventajas de la microscopía es que se pueden emplear los mismos fenómenos físicos, descritos en capítulos anteriores para el análisis de biomacromoléculas in vitro, pero ahora incorporando también información espacial, en particular, en relación a las estructuras biológicas relevantes de cada sistema en estudio, como la estructura de un tejido, la célula, el núcleo, organelas, etc.Facultad de Ciencias Exacta

Técnicas de microscopía óptica

Durante los últimos años, las técnicas de microscopía óptica y sus aplicaciones han experimentado un auge sin precedentes. Más concretamente, la difusión de sistemas de microscopía confocal durante los 90 ha empujado con fuerza el desarrollo de la microscopía de fluorescencia y abierto nuevos horizontes de investigación. Este fenómeno ha venido propiciado por varios motivos. Por una parte, los progresos en la tecnología de detectores fotosensibles, tanto chips CCD (charge-coupled devices) como fotomultiplicadores (PMT), cada vez de mayor resolución y sensibilidad.

Método de aclaramiento óptco para visualización de fluorescencia de tejidos neuronal y vascular en LSFM y su comparación con LSCM y SIM

Los tejidos nerviosos y vascular forman intrincados circuitos y redes cuya organización se hace difícil entender a partir de cortes en dos dimensiones. Extraer información detallada con una perspectiva global de una muestra u órgano intacto ha sido un desafío fundamental en biomedicina y biotecnología, ya que en su mayoría los tejidos biológicos son opacos, lo que dificulta la penetración de la luz, restringiendo el contraste y visualización de la estructura interna. La mayoría de las técnicas de corte histológico convencional proporcionan información bidimensional sobre las estructuras anatómicas y los componentes celulares dentro de las muestras de tejidos, sin embargo, estos son prácticamente tridimensionales, por lo que se hace necesario visualizar su forma tridimensional. Con el objetivo de optimizar un método de aclaramiento óptico para visualización de tejidos neuronal y vascular inmunomarcados en su forma tridimensional en Light-Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM), se probaron varios protocolos de aclaramiento hidrofóbicos e hidrofílicos para obtener una transparencia de cerebros y ojos de ratones C57BL/6 y ratas Long-Evans (Métodos CLARITY, 3DISCO y Etanol-ECi), así como muestras enteras de retinas no aclaradas. Con modificaciones del método Etanol-ECi se logró obtener una alta eficacia de aclaramiento, a partir de la cual se pudieron adquirir imágenes en LSFM y contrastarlas con imágenes de muestras adquiridas con Laser-Scanning Confocal Microscopy (LCFM) y Structured Illumination Microscopy (SIM). Estas modificaciones suponen un avance en el campo de la microscopía, especialmente para el estudio de procesos relacionados con la neovascularización o la degeneración neuronal.The nervous and vascular tissues form intricate circuits and networks whose organization is difficult to understand from two-dimensional cuts. Extracting detailed information with a global perspective of an intact sample or organ has been a fundamental challenge in biomedicine and biotechnology, since most biological tissues are opaque, which makes it difficult for light to penetrate, restricting contrast and visualization of the internal structure. Most conventional histological cutting techniques provide two-dimensional information on the anatomical structures and cellular components within the tissue samples; however, these structures are practically three-dimensional. In order to optimize an optical clearance method for visualization of immunolabelled neuronal and vascular tissues in their three-dimensional form in Light-Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM), various hydrophobic and hydrophilic clearance protocols were tested to obtain transparency of brains and eyes of C57BL / 6 mice and Long-Evans rats (CLARITY, 3DISCO and Ethanol-ECi methods), as well as whole unclear retinal samples. With modifications of the Ethanol-ECi method, it was possible to obtain a high clearance efficiency, from which images were acquired in LSFM and compared with images of samples acquired with Laser-Scanning Confocal Microscopy (LCFM) and Structured Illumination Microscopy (SIM). These modifications represent an advancement in the field of microscopy, especially for the study of processes related to neovascularization or neuronal degeneration

Estrategias de mejora en microscopía por iluminación o colección estructurada

Existen dos límites que nos impone la naturaleza ondulatoria de la luz y que no seremos capaces de sobrepasar con las técnicas proporcionadas por la microscopía convencional: la resolución predicha por la difracción y la capacidad de seccionado óptico. En este trabajo se han estudiado las propiedades ópticas de distintos sistemas de microscopía manipulando convenientemente el modo en el que se ilumina la muestra o en el que se registra la luz que parte de la misma. Este amplio estudio ha llevado al conocimiento necesario para realizar modificaciones de algunas técnicas en algún caso, o la invención de nuevas técnicas en otros casos, para la mejora de estas propiedades ópticas. En primer lugar, presentamos la microscopía convencional, presentando las propiedades ópticas y limitaciones que presentan estos sistemas formadores de imágenes, como son el límite de resolución, la ausencia de seccionado óptico y la velocidad de procesamiento, con el fin de incorporar nuevas alternativas que mejoren estas limitaciones. A continuación, se presenta la descripción de la técnica principal de estudio, la microscopía por iluminación estructurada. Inicialmente, detallaremos la técnica tal cual es utilizada por la comunidad científica en la mayor parte de los casos. Recopilaremos todo el proceso de esta técnica desde la iluminación hasta la captura, describiendo con detalle todas sus virtudes e inconvenientes. Veremos cómo una estimación errónea del desplazamiento del patrón de iluminación se transforma en una interpretación equivocada con la consecuente reconstrucción defectuosa de la información tridimensional de la muestra. En este punto introduciremos una nueva técnica con la que hemos conseguido estimar de forma precisa el desplazamiento del patrón de iluminación. Otro de los inconvenientes prácticos de la técnica está relacionada con la variación del contraste del patrón de iluminación tridimensional. Para minimizar este efecto se abordar el diseño de un montaje óptimo del sistema óptico para maximizar el contraste del patrón de iluminación. Por último, tras una revisión profunda de este tipo de sistemas de iluminación y captura, desarrollamos una nueva técnica de microscopía basado en los principios físicos de las técnicas microscopía por iluminación estructurada y confocal que puede llegar a sustituirlas en el desarrollo de la investigación científica por su potencialidad y mejora de las propiedades ópticas alcanzables por estas técnicas. Esta nueva técnica es capaz de conseguir duplicar la resolución de un sistema óptico convencional y obtener seccionado óptico de la muestra simultáneamente, algo inalcanzable con las técnicas existentes hoy en día. Es tal la potencialidad de esta nueva técnica, a la que hemos llamado microscopía por Iluminación estructurada escaneada, que a día de hoy se encuentra en las últimas fases del proceso de patente

Análisis estructural y funcional de macromoléculas

El objetivo de este libro es incentivar a alumnos y docentes del área de bioquímica y afines a acercarse a un grupo de metodologías modernas que se aplican a la comprensión de los principios moleculares responsables de los procesos biológicos, en particular aquellos referidos a las proteínas. Desde los años ´90, el advenimiento de la genómica y proteómica ha permitido identificar un gran número de proteínas para las cuáles sólo se cuenta con su estructura primaria. Para profundizar la caracterización estructural y funcional de dichas proteínas, ha sido necesario contar con diversas herramientas bioquímicas y biofísicas. Hoy en día se han desdibujado los límites entre las distintas disciplinas de las ciencias naturales, siendo necesaria una visión integral, provista por la biofisicoquímica, que abarque las técnicas complementarias disponibles actualmente. (Párrafo extraído del texto a modo de resumen)Facultad de Ciencias Exacta

Eficacia in vitro de la luz ultravioleta con poca iluminación y buena iluminación en la eliminación del remanente de adhesivo ortodóntico en dientes bovinos. Arequipa 2020

El objetivo era ver el nivel de eficacia al eliminar los remanentes de adhesivo ortodontico con propiedad de producir luminiscencia a la luz ultravioleta en ambientes con buena o poca luminosidad al momento de retirar los remanentes de adhesivo. Dos grupos de dientes bovinos compuesto por 18 muestras cada uno fueron colocados en troqueles de metal. Se uso adhesivo ortodontico Orthocem UV© Se unió con alambre de ligadura #10 los dientes bovinos a un dinamómetro digital y se hizo tracción al bracket de marca Azdent (China) para desprenderlo de las piezas dentarias. Se midió la tracción en Newtons y luego se hizo la conversión a megapascales con un dinamómetro digital (mediana 23,74, chi2 de 1,125) Luego se cortó la corona clínica de los dientes al nivel del límite amelocementario y bajo un microscopio digital de luz ultravioleta se midió los mm2 de remanente que quedaron en la superficie del esmalte con la ayuda del software ImageJ©. Antes de la eliminación del remante con fresa de carburo de 8 hojas se midió los lúmenes del ambiente con el aplicativo Light Luz meter© en un Iphone 11pro de la Empresa Apple©. Se escogía al azar los dientes de los cuales se eliminará el remanente de adhesivo ortodontico con los estándares que determinan que un ambiente está bien iluminado o poco iluminado. En ese momento, se midió el tiempo empleado en cada pieza dentaria al eliminar el adhesivo de la superficie de los dientes bovinos. Seguidamente se volvía a colocar la corona del diente bovino bajo la luz ultravioleta para medir la cantidad de remanente que quedo después de la eliminación de este. Se tabuló en una hoja de Excel los resultados y luego se uso el software SPSS para realizar los cálculos estadísticos. El Nivel II de eliminación (1 al 5% de remanente de adhesivo) es el grupo donde se vio mayor eficacia en el procedimiento de retirar los remanentes de adhesivo. No se hallo diferencias estadísticamente significativas al usar buena o poca iluminación, (p>0,005) en todos los niveles, pero si se hallo diferencias estadísticamente significativas en el tiempo empleado al momento de eliminar de eliminar el remanente de adhesivo. (p<0,005) Con poca iluminación se logró una media de 19,31 segundos y con buena iluminación con una media de 25,94 segundos. Recomendamos usar poca iluminación ambiental al momento de eliminar el remanente de adhesivo ortodontico pues la luz ambiental modifica la intensidad de la luz ultravioleta

UV-Vis Luminescence imaging techniques/ Técnicas de imagen de luminiscencia UV-Vis

Ever since its first introduction in the field of conservation, the role of UV-VIS luminescence/fluores-cence (UVL and UVf, respectively) imaging has been expanding.The unique and significant contribution of this technique for investigation of cultural heritage has led to the development of new methodol-ogies and applications. Each chapter in this volume can be read independently. While this means that some repetition may occur between the individual chapters, in particular regarding the explanation of terminology and methodology, such overlap provides interesting op-portunities for cross-comparison of both terminol-ogy and methodology. In addition, it highlights similarities and differences between different situations in the practical applicationFuster López, L.; Stols-Witlox, M.; Picollo, M. (2020). UV-Vis Luminescence imaging techniques/ Técnicas de imagen de luminiscencia UV-Vis. Editorial Universitat Politècnica de València. http://hdl.handle.net/10251/138517EDITORIA